1 范圍

本標準規(guī)定了動物性食品中常山酮殘留量檢測的制樣和高效液相色譜測定方法。

本標準適用于雞的肌肉和肝臟組織中常山酮殘留量的檢測。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的xin版本。凡是不注日期的引用文件，其xin版本適用于本標準。

GB/T 1.1-2000標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則

GB/T 6682分析實驗室用水規(guī)則和試驗方法

3 原理

試料中殘留的常山酮，用胰蛋白酶酶解，乙酸乙酯提取，液液萃取，HLB柱凈化，高效液相色譜-紫外測定，外標法定量。

4 試劑和材料

以下所用試劑，除特殊注明外均為分析純試劑，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

4.1 氫溴suan常山酮對照品：含量≥99.6%。

4.2 甲醇：色譜純。

4.3 乙酸乙酯：色譜純。

4.4 乙腈：色譜純。

4.5 無水碳酸鈉

4.6 胰蛋白酶1000U/mg。

4.7 乙酸銨

4.8 乙酸

4.9 甲苯

4.10 HLB固相萃取柱：500mg/6mL,或相當者。

4.11 0.25mol/L乙酸銨緩沖液：取乙酸銨19.27g,加乙酸30mL,用水溶解并稀釋至1000mL,用乙酸調(diào)PH至4.3。

4.12 0.125mol/L乙酸銨緩沖液：取0.25mol/L乙酸銨緩沖液500mL,用水溶解并稀釋至1000mL。

4.13 10%碳酸鈉溶液：取無水碳酸鈉10g,用水溶解并稀釋至100mL。

4.14 流動相：取乙腈250mL、0.25mol/L乙酸銨緩沖液150InL和水600mL,混勻，用冰乙酸調(diào)PH至4.3,濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.15 200ug/mL常山酮標準貯備液：精密稱取氫溴suan常山酮標準品10mg,于50ml棕色量瓶中，用0.25mol/L乙酸銨緩沖液溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為200ug/mL的常山酮標準貯備液。密封，用鋁箔包裹，2～8℃避光保存，有效期6個月。

4.16 10ug/mL常山酮標準貯備液：精密量取200ug/mL常山酮標準貯備液0.5mL于10mL棕色量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為10ug/mL常山酮標準貯備液。密封，用鋁箔包裹，2～8℃避光保存，有效期為6個月。

5 儀器和設(shè)備

5.1 高效液相色譜儀：配紫外檢測器。

5.2 分析天平：感量0.00001g。

5.3 天平：感量0.01g。

5.4 離心機

5.5 均質(zhì)機

5.6 渦旋振蕩器

5.7 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

5.8 氮吹儀

5.9 固相萃取裝置

5.10 恒溫水浴箱

5.11 濾膜：0.45um。

6 試料的制備與保存

6.1 試料的制備

取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，絞碎，并使均質(zhì)。

—取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。

—取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。

—取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試料。

6.2 樣品的保存

-20℃以下保存。

7 測定步驟

7.1 基質(zhì)匹配標準曲線的制備

精密量取10ug/mL的常山酮標準貯備液適量，用甲醇溶解并稀釋,配制成濃度為50、100、300、500和1000ug/L的系列標準溶液，各取1.0mL,分別加至經(jīng)提取、凈化步驟處理的空白試料洗脫液中，于38℃水浴下氮氣吹干，用流動相1.0mL溶解殘余物，供高效液相色譜法測定。以測得峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

7.2 提取

稱取試料(4±0.04)g,于100mL離心管中，加胰蛋白酶50mg,加水2mL(肝臟組織)或水10mL(肌肉組織)，渦動1min,用10%碳酸鈉溶液調(diào)PH至8.0,于40℃水浴下酶解3h。取出，放至室溫，加10%碳酸鈉溶液2mL,渦動1min,再加乙酸乙酯20mL,渦動10s,在冰水浴中靜置3min,立即2000r/min離心2min,將上清液轉(zhuǎn)入100mL分液漏斗中。下層液用乙酸乙酯20mL重復提取一次，合并兩次上清液于同一分液漏斗中，加0.125mol/L乙酸銨溶液10mL,振搖1min,靜置2min,收集下層水相。再加0.125mol/L乙酸銨溶液10mL,重復萃取一次，合并兩次水相，轉(zhuǎn)至雞心瓶中，于38℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除盡殘余的乙酸乙酯，備用。

7.3 凈化

HLB柱依次用甲醇3mL、水3mL和0.125mol/L乙酸銨3mL活化，取備用液過柱，控制流速1mL/min,用甲苯2mL洗滌，擠干，用甲醇3mL洗脫，收集洗脫液，于38℃氮氣吹干，用流動相1.0mL溶解殘余物，混勻，濾膜過濾，供高效液相色譜法測定。

7.4 測定

7.4.1 色譜條件

色譜柱：C₁₈(150mm×3.9mm,粒徑4um),或相當者；

流動相：乙腈-0.25mol/L乙酸銨緩沖液-水；

流速：1.0mL/min；

柱溫：30℃；

檢測波長：243nm；

進樣體積：25uL。

7.4.2 測定法

取試樣溶液和相應的對照溶液，做單點或多點校準，按外標法，以峰面積計算。對照溶液及試樣溶液中常山酮響應值應在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。

7.5 空白試驗

除不加試料外，采用*相同的步驟進行平行操作。

8 結(jié)果計算和表述

試料中常山酮的殘留量(ug/kg)：按下式計算

式中：

X—供試試料中常山酮的殘留量，ug/kg;

C—試樣溶液中常山酮濃度，ug/mL;

V—溶解殘留物所用流動相體積，mL；

m—供試試料質(zhì)量，g。

注：計算結(jié)果需扣除空白試料值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

9 檢測方法靈敏度、準確度和精密度

9.1 靈敏度

本方法檢測限為25ug/kg；定量限為50ug/kg。

9.2 準確度

本方法在50～500ug/kg添加濃度水平上回收率為80%～110%。

9.3 精密度

本方法的批內(nèi)相對標準偏差≤15%,批間相對標準偏差≤20%。